流式细胞术培训

第 4 部分：疑难解答

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欢迎来到我们的流式细胞术系列培训。我们首先介绍一些基本知识，比如了解您的细胞仪，接着介绍一些细节，最后介绍如何充分利用这项强大的技术。

欢迎来到流式细胞术培训的最后一部分。使用流式细胞术时，您可能会遇到不同的问题，在这一部分，我们将与您分享一些疑难解答提示。

第 4 部分 概述

4.1 疑难解答视频 —— 无信号/高背景
4.2 补偿、光谱重叠和溢出计算
4.3 解决遇到的其他问题
4.4 常见问题解答

4.1 疑难解答视频 —— 无信号/高背景

染色时遇到的主要问题是无信号或高背景。下面的短视频解释了如何解决这些问题。

4.2 补偿、光谱重叠和溢出计算

在本视频中，我们将讨论如何进行补偿，特别是如何计算溢出的光谱重叠，以及补偿与稳定性的关系。

4.3 解决遇到的其他问题

我们已经讨论了遇到任何无信号或高背景问题时该怎么办；但是，您可能还会遇到其他问题，例如：

1. 无信号/荧光强度弱

信号补偿不正确
检查流式细胞仪上单色阳性对照是否设置正确，以及门控和补偿设置是否正确，确保您能捕获所有事件。

用于检测的抗体不足
增加抗体量或抗体浓度。

无法接近细胞内靶标
检查靶蛋白是否是位于细胞内，或者膜蛋白的抗体表位是否位于细胞内。关于细胞内染色，确保充分透化。为防止细胞表面蛋白质发生内化，所有操作步骤必须在冰上或 4℃ 下用预冷的交联试剂完成，以阻止所有细胞反应。

在实验试剂中添加叠氮化钠可阻止表面抗原的调变和内化，但会导致荧光强度损失。对于粘附细胞系的染色，胰蛋白酶通常可以诱使细胞表面蛋白发生内化，并且可能需要更温和的分离方法。

细胞内染色 - 荧光染料结合分子太大
细胞内染色实验应使用小分子量的荧光染料。分子量大的荧光染料会降低抗体活性，阻止抗体进入细胞标记目标蛋白。

激光器未对齐
确保流式细胞仪上的激光器正确对齐，必要时通过运行液流检查微珠来调整路线。如果激光器未正确对齐或发生偏移，则可能需要考虑维修机器。

靶蛋白不存在/低水平表达
确保您正在分析的组织/细胞类型能表达靶蛋白，并且靶蛋白的量足以被检出。

可溶性/分泌性靶蛋白
靶蛋白是否可溶并由细胞分泌？靶蛋白需要嵌合在细胞膜上或存在于细胞质里，以便轻松通过流式细胞术检出。通过高尔基体封闭步骤，例如加入 Brefeldin A，可以改善细胞内的染色信号。

补偿过高/增益过低
使用阳性对照正确设置流式细胞仪，利用补偿确保细胞的荧光信号不被切断，提高增益以增强信号（在合理范围内 - 应谨慎操作）。

荧光染料的荧光消退
抗体可能存放太久或没有避光。需要新鲜抗体。

一抗和二抗不匹配
使用的二抗应与一抗来源种属不同（例如，一抗为兔源，则应该使用抗兔源二抗）。为了解决种属交叉反应性的问题，您可以使用经流式细胞术验证的直接偶联一抗，或者使用偶联物试剂盒，在您选择的抗体中加入合适的荧光染料。

2. 荧光强度高

抗体浓度过高
会导致强非特异性结合或高荧光强度。减少每个样本中添加的抗体量。

过量抗体被捕获
可能是胞内染色特有的问题，这种情况下，抗体上的大荧光染料分子可能被捕获在细胞内。确保洗涤步骤充分，并在洗涤缓冲液中加入吐温或 Triton，以保持细胞的透化作用。

封闭不足
在您的抗体混合液中加入 1% - 3% 封闭剂，并增加封闭步骤。

3. 背景高/阳性细胞百分比高

增益设置过高/补偿过低
使用阳性对照正确设置流式细胞仪，使用补偿减少小颗粒背景信号并减少增益，以降低信号。

抗体过量
降低抗体浓度。还可以在洗涤缓冲液中添加去污剂，确保洗去过量的抗体。

4. 在应该只有一个细胞群的情况下观察到两个或多个细胞群

表达靶蛋白的细胞群不止一个
检查样本包含的细胞类型的预期蛋白表达水平，如有必要，确保细胞充分分离。

出现细胞双峰
细胞双峰在印迹上显示为第二大细胞群，其荧光强度大约是印迹上荧光强度的两倍。染色前用移液枪将细胞轻柔混匀，放入细胞仪中运行前再次混匀。也可以筛选或过滤细胞，以去除团块（30 μL 尼龙网）。

5. 侧向散射背景偏高（来自小颗粒）

细胞裂解
确保样本中的细胞没有裂解和破碎。样本应新鲜，并正确制备。不要在高转速的情况下对细胞进行离心或激烈涡旋。

细菌污染
确保样本不受污染。细菌会自动发出较弱的荧光，导致高事件率。

6. 低事件率

每毫升的细胞数过少
运行 1 × 10⁶个细胞/mL。确保细胞混合均匀（轻柔混匀）。

细胞聚集，阻塞管道
染色前轻轻吹打几次，确保得到同源单细胞悬液。确保上机前再次混匀。极端情况下，可以筛选或过滤细胞，以去除团块（30 μL 尼龙网）。

7. 高事件率

细胞数量过多
稀释至 1 × 10⁵至 1 × 10⁶个细胞/mL。

4.4. 流式细胞术常见问题解答

样本需要固定吗？染色前还是染色后固定？

任何含有潜在生物危害物质的样本都应该固定。建议染色完成后在样本中加入 1% - 2% 的多聚甲醛。然后将样本置于 4℃ 下避光保存并在 24 小时内对样本进行分析。

对于细胞内染色，在该过程中同时固定和透化细胞。浏览我们的细胞内染色指南，获取更多信息。

细胞需要透化吗？

我们建议您查看数据表，以获取更多详细信息。如果您检测的靶蛋白是膜蛋白，那么很可能不需要透化步骤。在极少数情况下，抗体表位可能位于膜蛋白的胞浆区。在这种情况下，您可能需要用温和的透化剂（如皂苷）进行透化。查看数据表中的数据（或 Abreviews 和图像），了解其他研究人员是否需要透化步骤。所有细胞质和细胞核靶蛋白都需要进行细胞透化，以供抗体检测。如果需要详细的实验方案，请查看我们的细胞内染色指南。

小结

我们的流式细胞术系列培训到此结束。希望您现在不仅能够设计和运行流式细胞术实验，而且还能在出现问题时解决问题。

如果您已准备就绪，可以参加们的流式细胞术测试，以检验您对新知识的掌握程度。

此外，请密切关注我们的主培训页面，以防您需要复习或掌握实验室中的其他常见应用。