流式细胞术培训

第 3 部分：补偿和数据分析

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欢迎来到我们的流式细胞术系列培训。我们首先介绍一些基本知识，比如了解您的细胞仪，接着介绍一些细节，最后介绍如何充分利用这项强大的技术。

现在进入流式细胞术培训的第 3 部分，该获取数据了。在这一部分，我们将为您介绍实验设计和多色实验的补偿设置。最后我们会提供一份处理数据的可视指南。

第 3 部分 概述

3.1 实验设计
3.2 补偿
3.3 运行流式细胞术实验并可视化数据

3.1 实验设计

在前面的部分，我们已经介绍了流式细胞术的基础知识、样本制备和不同的染色方案。接下来，我们来了解一下如何运用我们所学的知识设计流式细胞术实验。

1. 掌握流式细胞仪。了解激光的数量和类型、检测器的数量以及滤光片的类型。根据荧光染料的激发波长匹配可用的激光，同时根据荧光染料的发射波长匹配滤光片。

2. 根据您的需要选择荧光基团：如果抗原表达水平较低或不明并且细胞数量较少，选择最亮的荧光染料；如果抗原表达水平较高，选择较暗的荧光染料。

3. 考虑所有光谱重叠。

4. 使用合适的对照品，如未染色的细胞、活/灭活细胞标志物、单染色阳性对照和荧光减一染色对照。

5. 确定使用间接染色还是直接染色，然后优化抗体浓度并在需要时使用 Fc 封闭。

在以下视频中，我们将带您了解实验设计的全部内容，包括材料、对照和试剂，确保您能设计复杂的流式细胞术实验。

下图是一张简明示意图，有助于您设计流式细胞术多色组合。

• 开展多色流式细胞术实验时，您可以使用直接偶联一抗（例如 Alexa Fluor^®染料），这样可以加快并简化试验方案，还可以省去二抗染色步骤。您选择偶联一抗时，请留意抗体特异性。理想情况下，可以选择重组单克隆抗体，它们的特异性和批间一致性较高。

• Abcam 提供多种直接与各种荧光标记（Alexa Fluor^®染料、FITC、PE、APC、PerCP）偶联的重组一抗，这些一抗均已通过流式细胞术验证。如果您选择的抗体没有合适的偶联形式，您可以使用 Abcam 的抗体偶联试剂盒。

获取我们的完整多色流式细胞术指南，帮您设计完美的多色实验。

3.2 补偿

多色流式细胞术非常实用，它能在相对较短的时间内生成大量数据。对单个细胞上的多种蛋白使用多种抗体，可以从少量样本中获得比进行序列分析更详细的图像。

但是，由于一抗较多，需要通过多个荧光基团进行区分，所以发射光谱可能会重叠，导致您在单个通道中检测到多个荧光基团的荧光，从而得出假阳性信号。补偿是运行多色流式细胞术实验时解释重叠发射光谱的过程。

以下视频介绍了如何为多色流式细胞术选择荧光染料，以及如何进行多色补偿。

无论是何种细胞仪，进行荧光补偿的步骤基本相同。以下是一些基本提示：

• 如果一些荧光染料组合的发射光谱重叠度高，应避免使用此类组合（例如 APC 和 PE-Cy5）。

• 您需要为每种荧光染料设置补偿对照，并且应包含阳性和阴性对照细胞群。

• 通常，补偿设置从处于光谱远红端（波长较长）的荧光染料开始，逐步往下至光谱底端的荧光染料。务必检查所有通道的补偿情况。

• 溢出通道中阴性细胞群的中位数等于阳性细胞群的中位数时，您的补偿设置正确。

以下短视频将给出一个三色实验补偿的特殊案例。

如需了解关于如何处理补偿的更多信息，请查看我们的指南。

3.3 运行流式细胞术实验并可视化数据

现在，您已经了解了如何设计流式细胞术实验及设置补偿对照，接下来就可以开始实验了。下面的视频介绍了流式细胞术实验的主要步骤。

数据的可视化和分析方法有很多，本质上这些方法没有对错之分。以下信息可以帮助您了解哪种方法最能体现您的数据。

• 直方图：如果大多数细胞表达目标标志物，且染色明亮时，那么直方图的效果最佳。平均荧光强度（MFI）是亮度的量度，也是丰度的相对量度。

• 散点图：根据您的样本，您可以仅使用 FSC/SSC 绘制细胞群分布图，以作进一步分析。但通常情况下，如果样本中的多个细胞群具有相似的 FSC/SSC 图或与其他细胞类型共享标志物，那么使用两种荧光标志物可以更加清楚地区分您的细胞群。

• 设门：绘制门控可帮助您定量细胞群。请记住，门控代表总细胞群的一个细胞亚群。如果您想深入了解其中的某一细胞群并为其创建了一个门控，那么您需要反向计算总细胞群。

以下视频介绍了可视化数据的不同方法。

下图给出了设门策略、百分比计算以及细胞团块去除方面的提示。

小结

我们第 3 部分的数据培训到此结束。您已经可以更好地进行以下操作了：

• 设计流式细胞术实验
• 设置多色流式细胞术补偿
• 用流式细胞仪检测样本并可视化数据

在最后一部分的培训中，我们将进行疑难解答，确保您能快速解决流式细胞术中最常见的一些问题。

现在开始学习第 4 部分吧！