流式细胞术培训

第 2 部分：样本制备和染色

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欢迎来到我们的流式细胞术系列培训。我们首先介绍一些基本知识，比如了解您的细胞仪，接着介绍一些细节，最后介绍如何充分利用这项强大的技术。

在流式细胞术培训的第 2 部分，我们将为您介绍一些基本步骤，如样本制备、对照设置、直接染色与间接染色的选择以及细胞内染色操作。

第 2 部分 概述

2.1 样本制备
2.2 对照
2.3 直接染色与间接染色
2.4 细胞内染色

2.1 样本制备

样本制备对您的数据质量影响极大。观看我们的短视频，了解为何制备单细胞悬浮液对流式细胞术而言如此重要，以及如何操作制备单细胞悬浮液。

以下是关于流式细胞术样本制备的一些重要提示：

• 最大限度地减少非特异性结合 - 使用 BSA 或 FBS 作为封闭剂。

• 最大限度地减少抗体与 Fc 受体的结合 - 在样本染色期间加入 10% 同源血清或 5 mg/mL 未标记的 IgG。

• 如果研究细胞内标志物，透化细胞膜 - 使用低浓度的非离子洗涤剂（最高 0.1%）。

• 如果使用活细胞，防止细胞表面蛋白的内化 - 所有步骤在冰上进行，使用前在 4℃ 下冷藏试剂。

• 防止细胞损伤 - 避免出现气泡、剧烈涡旋、更换缓冲液时吸出全部溶液以及过度离心。

• 防止细胞死亡引起的结块 - 添加 DNAse I（25 - 50 μg/mL）和 5 mM MgCl₂。

• 防止阳离子依赖型细胞粘附 - 使用不含 Ca²⁺/Mg²⁺的缓冲液。您最多可以添加 5 mM EDTA，以进一步防止细胞粘附。在此情况下，您应该使用 BSA（0.1%-1%）或经透析的 FBS（1%-5%），因为未透析的 FBS 会取代 Ca²⁺/Mg²⁺。

• 使用单细胞悬液 - 如果可能，使用细胞滤网过滤器过滤样本。如果没有，可以使用尼龙网筛，但这样可能会损失细胞。

• 防止堵塞系统 - 将细胞浓度维持在合理的浓度内 (1 x 10⁶–10 x 10⁶ 个细胞/mL).

2.2 对照

合适的对照可以帮助您区分真假结果并发现方法中存在的潜在问题。因此，您必须花时间正确设置对照。

设计实验时，请确保您在以下步骤加入了合适的对照：

细胞活性

由于非特异性结合和自发荧光水平增加，死细胞可能产生假信号，导致错误的结论。

• 使用活性标志物（如 7-氨基放线菌素 D（7-AAD）、碘化丙啶、核绿 DCS1 或 DRAQ7™）来区分活细胞群和死细胞群。

自发荧光

天然存在的细胞组分如 NADPH 和黄素，可以发出可能掩盖抗原特异性信号的荧光。

• 使用等分的未染色细胞来控制自发荧光。您还可以使用未染色细胞来定义阴性细胞群、细胞大小和粒度。

光谱重叠

可以在不同的通道中检测到一个荧光基团发射出的荧光。这种现象会严重影响给定通道的测量结果。

• 使用荧光减一（FMO）对照测定给定通道中溢出的量度。这里，除了正在检测的荧光偶联物，用所有其他荧光偶联物对样本进行染色，突出其他荧光偶联物对未标记通道信号的影响。

• FMO 对照是多色实验的基础，因为它能确保正确的门控，并仅选择实验样本中的染色细胞进行分析。

• 浏览我们详细的 补偿指南，了解更多相关信息。

不需要的抗体结合

从广义上来说，不需要的抗体结合包括所有影响数据正确解读的抗体结合。当抗体与靶外表位或 Fc 受体结合（但不属于受体-配体相互作用），或通过其偶联的荧光基团与某一表位或抗原结合时，会发生不需要的抗体结合。

• 使用阴性对照和同型对照可以解释这一点。

• 阴性对照应该是不表达目标抗原的细胞群；如果可能，请使用基因敲除细胞。该样本应与研究用细胞群采用相同的实验条件。使用阴性对照来设置门控区域并从阴性细胞中区分阳性细胞。

• 同型对照用于确定由非特异性抗体结合引起的背景。同型对照使用与一抗同型的抗体，但只能和研究细胞中缺失的的抗原发生特异性结合。使用同型对照可以确定由非特异性抗体结合引起的背景。但是不能区分阳性细胞和阴性细胞或设置阳性门控区域。

请参阅我们的完整推荐对照列表。

2.3 直接染色与间接染色

直接和间接实质上是指检测分子的位置，即荧光基团。对于直接流式细胞术，荧光基团直接与一抗偶联。在间接流式细胞术中，荧光基团与结合一抗的二抗偶联 —— 这样可以通过额外的方案步骤来扩增信号。这个视频您介绍了直接与间接流式细胞术实验方案的主要步骤。

下载我们的直接和间接流式细胞术实验方案。

2.4 细胞内染色

虽然流式细胞术常用于检测细胞表面标志物，如 CD 蛋白，但也可用于检测细胞内蛋白，如转录因子。要做到这一点，您需要在染色细胞之前使用固定和透化步骤。

如果需要了解更多信息，请参考我们的细胞内染色实验方案。

小结

第 2 部分结束后，您应该很好地了解了：

• 样本制备的关键点
• 各种类型的对照及其操作方法
• 直接染色与间接染色
• 检测细胞内蛋白时应如何修改流式细胞术实验方案

在第 3 部分，我们将为您介绍流式细胞术的实验设置、补偿及数据分析。

现在开始学习第 3 部分吧！