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  • 抗体基础知识培训 
    第 4 部分：疑难解答


    欢迎参加我们的抗体选择及使用培训。本期培训的主题包括根据需求选择合适的抗体、抗体处理及储存、抗体验证及疑难解答等方面。

    计划再周全，也有出现偏差的时候。当出现偏差时，您需要一些经验证和测试的步骤来解决问题。由于免疫检测方法多种多样，很难归纳，为了尽快排除故障，您可以仅选择适合您应用的内容，获取相关疑难解答指南。


    第 4 部分 概述

    4.1 western blot 疑难解答
    4.2 IHC 及 ICC 疑难解答
    4.3 流式细胞术疑难解答


    4.1 western blot 疑难解答

    这份详细指南涵盖了一些最常见的问题，如无信号、高背景和多条带，以及对应的解决办法。

    完善您的 western blot

    我们有两个短视频介绍了如何解决无染色与高背景的问题，并提供了我们实验室遇到的其他常见问题示例。


    高背景与无信号疑难解答


    我们实验室的疑难解答示例



    4.2 免疫组织化学（IHC）及免疫细胞化学（ICC）疑难解答

    无论是处理组织还是细胞，您都可能遇到一些问题。我们的 IHC 和 ICC 指南介绍了诸多问题（例如无染色、非特异性染色和高背景）的起因。

    IHC 和 ICC 疑难解答

    如欲了解如何解决这些常见问题，请观看下面两个短视频，它们介绍了相关问题的主要起因及解决办法。

    IHC 疑难解答



    ICC 疑难解答



    4.3 流式细胞术疑难解答

    流式细胞术会让新用户倍感压力，尤其是在实验偏离计划时。为了确保一切更加顺利，我们的指南列出了 7 大问题及其解决办法。

    1.无信号/荧光强度弱

    信号补偿不正确
    检查流式细胞仪上单色阳性对照是否设置正确，以及通道和补偿设置是否正确，确保您能捕捉所有事件。
    用于检测的抗体不足
    增加抗体量或抗体浓度。

    无法接近细胞内靶标
    检查靶蛋白是否是位于细胞内，或者膜蛋白的抗体抗原表位是否位于细胞内。关于细胞内染色，确保通透步骤运行充分。为防止细胞表面蛋白质的内化，所有操作步骤都必须在冰上或 4℃ 下用预冷的试剂完成，以阻止所有的细胞反应。

    在实验的试剂中添加叠氮化钠可阻止表面抗原的修饰和内化，但这会导致荧光强度的损失。对于粘附细胞系的染色，胰蛋白酶通常可以引起细胞表面蛋白的内化，因此可能需要更温和的分离方法。

    细胞内染色 - 荧光染料结合分子太大
    用于细胞内染色实验的荧光染料应具有较小的分子量。分子量大的荧光染料会减少抗体的运动性，阻止抗体进入细胞标记您的目标蛋白。

    激光器未对齐
    确保流式细胞仪上的激光器正确对齐，必要时通过运行液流检查微珠来调整光路。如果激光器未正确对齐或发生偏移，则可能需要考虑维修机器。

     靶蛋白不存在/低水平表达
    确保您正在分析的组织/细胞类型能表达靶蛋白，并且靶蛋白的量足以被检出。 

    可溶性/分泌性靶蛋白
    靶蛋白是否可溶并由细胞分泌？靶蛋白需要嵌合在细胞膜上或存在于细胞质里，以便能很容易地被流式细胞仪检出。通过高尔基体封闭步骤，例如加入 Brefaldin A，可以改善细胞内的染色信号。

    补偿过高/增益过低
    包括使用阳性对照正确设置流式细胞仪，调整补偿以确保细胞的荧光信号不被截断，提高增益以增强信号（在合理范围内 - 应谨慎操作）。

    荧光染料的荧光消退
    抗体可能保存时间太久或没有避光。需要使用新鲜抗体。

    一抗和二抗不匹配
    使用的二抗应与一抗来源种属不同（例如，一抗为兔源，则应该使用抗兔源二抗）。

    2.荧光强度高

    抗体浓度过高
    会导致强非特异性结合或高荧光强度。减少每个样本中添加的抗体量。


    过量抗体被困
    可能是胞内染色特有的问题，抗体上的大荧光染料分子可能被困在细胞内。确保洗涤步骤充分，并在洗涤缓冲液中加入吐温或 Triton，以保持细胞的透化作用。

     封闭不足

    在您的抗体混合液中加入 1% - 3% 封闭剂，并增加封闭步骤。

    3.背景高/阳性细胞百分比高

    增益设置过高/补偿过低
    使用阳性对照正确设置流式细胞仪，调整补偿减少小颗粒背景信号并减少增益，以降低信号。

    抗体过量 
    降低抗体浓度。还可以将去污剂添加到洗涤缓冲液中，以确保洗去过量的抗体。

    4.在应该只有一个细胞群的情况下观察到两个或多个细胞群

    表达靶蛋白的细胞群不止一个
    检查样本包含的细胞类型的预期蛋白表达水平，如有必要，确保细胞充分分离。

     出现细胞对
    细胞对在结果中表现为出现第二个大细胞群，其中一群的荧光强度大约是另一群细胞荧光强度的两倍。染色前用移液枪将细胞轻柔混匀，放入细胞仪中运行前重复该操作。也可以筛选或过滤细胞，以除去团块（30 μL 尼龙网）。

    5.侧向散射背景偏高（来自小颗粒）

    细胞裂解
    确保样本中的细胞没有裂解和破碎。样本应新鲜，且制备正确。不要在高转速或激烈涡旋的情况下对细胞进行离心。

    细菌污染

    确保样本不受污染。细菌会自动发出较弱的荧光，导致高事件率。

    6.低事件率

    每毫升的细胞数过少
    运行 1x106 个细胞/mL。确保细胞混合均匀（轻柔混匀）。

    细胞聚集，阻塞管道
    染色前轻轻吸移几次，确保得到同源单细胞悬液。确保上机前再次混匀。极端情况下，可以筛选或过滤细胞，以去除团块（30 μL 尼龙网）。

    7.高事件率

    细胞数量过多
    稀释至 1x105 至 1x106 个细胞/mL。

    小结

    以上就是抗体基础知识系列培训的全部内容。我们希望您现在可以更好地使用这些工具，将您的研究提升至新的水平。正如您看到的，如果您愿意花时间正确地选择符合您需求的抗体，通过实验设置验证它的效果，添加可靠的对照并对抗体做出哪怕一点点优化，您都将获得更好、可重复性更高的结果。同时避免最常见的问题，因此，希望您不需要用到我们的疑难解答指南！

    如果您认为自己准备好了，可以参加我们的 抗体基础知识小测试，以检验您对新知识的掌握程度。

    我们会提供针对不同应用的新培训系列，请务必留意 Abcam 的培训页面。