抗体基础知识培训 

第 1 部分：选择合适的抗体

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欢迎参加我们的抗体选择及使用培训。本期培训的主题包括根据需求选择合适的抗体、抗体的处理及储存、抗体验证及疑难解答等方面。

在抗体基础知识系列培训的第 1 部分，我们将主要介绍首次选择抗体时需要考虑的主要因素，因为抗体选择对实验的特异性与灵敏度至关重要。您将学习到抗体结构及同种型、实验设置、一抗及其直接与间接检测法，以及二抗的选择。

第 1 部分 概述

1.1 抗体结构及同种型
1.2 选择合适的检测法
1.3 选择一抗
1.4 直接与间接检测法
1.5 选择二抗

1.1 抗体结构及同种型

抗体，又名免疫球蛋白 (Ig)，是一种由 B 细胞产生的大型 Y 形糖蛋白，可在免疫防御中起主要作用。抗体与病原体的特定分子（即抗原）发生特异性结合。

抗体以一个或者多个 Y 形单体存在，每个 Y 形单体由 4 条多肽链组成（图 1）。每个 Y 形单体包含两条相同的重链（H）和两条相同的轻链（L），重链和轻链的序列和长度不同。Y 形单体的顶部包含可变区（V），也称抗原结合片段（F(ab)）区。该区可与给定抗原上的表位特异性紧密结合。

抗体的基本结构包含恒定区（C）和可结晶片段（Fc）区。这一区域对抗体的免疫应答功能非常重要。此外，将荧光染料和酶经共价键连接到抗体的 Fc 部位，可实现实验的可视化。

图 1.抗体结构。 Y 形抗体通过弹性的铰链区连接到中部。抗原结合发生在由免疫球蛋白重链（H）和轻链（L）组成的可变区（V）。抗体的基本结构由恒定区（C）组成。

根据多肽序列的微小差异，抗体的轻链都可分为 kappa (κ) 型或 lambda (λ) 型。重链结构决定了各个抗体的总类。

哺乳动物体内的抗体分为 5 种同种型：IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE。如图 2 所示，各个同种型都有其独特的结构。这些同种型因 Y 形结构的数量和重链种类而异。它们的生物学特性、功能区域以及结合不同抗原的能力有所不同。

图 2.抗体结构及同种型。

1.2 选择合适的检测法

研究内容	目标应用	用途	样本类型	数据类型
定位	IHC	测定细胞定位	固定细胞 及组织	定性及半定量
	ICC	测定亚细胞定位	固定细胞	定性及半定量
浓度	WB	测定蛋白相对含量	细胞及组织裂解液	半定量
	ELISA	准确定量蛋白含量	血清、血浆 活或固定 细胞或组织	定性及定量
相互作用	ELISA	检查分子相互作用	血清、血浆、细胞或组织	定性及定量
表达	FCM 或 FACS	分析细胞属性，例如大小、细胞表面标志物的表达	固定或活细胞	定量
识别	ELISPOT	识别分泌目标分析物的具体细胞	活细胞	定性及定量

Conc. = 浓度；IHC = 免疫组织化学；ICC = 免疫细胞化学；ELISA = 酶联免疫吸附试验；FACS = 荧光活化细胞分选技术；FCM = 流式细胞术；ELISPOT = 酶联免疫斑点法；WB = western blot

1.3 选择一抗

选择一抗时，需要考虑以下因素：

克隆性

选择抗体时，需考虑的重要因素之一是克隆性。克隆性取决于抗体来自亲代克隆的不同 B 细胞（多克隆抗体）还是相同 B 细胞（单克隆抗体）。这些抗体有各自的优点和局限性。

多克隆抗体是一种异型抗体混合物，其中的抗体来源于多个 B 细胞的免疫应答过程，并且每种抗体均可识别同一抗原的不同表位。由于多克隆抗体可检测蛋白上的一系列表位，因此与单克隆抗体相比，它们批间变异的风险更高。但是，由于多克隆抗体对单一表位不存在特异性，因此与单克隆抗体相比，它们对抗原微小变化的宽容性更强。

单克隆抗体由单个 B 细胞亲本克隆产生，因此，只能识别单个抗原的一个表位。单克隆抗体对靶向的抗原表位具有高度特异性，非特异性交叉反应性低，批间变异很小。

下面的视频通过靶向组蛋白修饰的抗体示例，阐述了多克隆抗体与单克隆抗体之间的差异。

单克隆抗体通常使用免疫动物的 B 细胞制备，通过融合永生细胞系形成分泌所需抗体克隆的杂交瘤细胞。该杂交瘤技术可大量生产一致性高、特异性强、灵敏度高的单克隆抗体。然而，随着时间的推移，杂交瘤细胞系会出现遗传漂变，导致抗体出现微小差异。

目前，人们对靶向高难度靶点（即毒素、核苷酸和膜结合蛋白）的抗体的需求日益增加，这些抗体并不都能用这种 in vivo 模式生产出来。

重组抗体在 in vitro 环境中将免疫特异性重链和轻链抗体基因克隆到高产表达载体中产生。接下来，这些载体会被引入表达宿主（例如细菌、酵母或哺乳动物）中，用于生产重组单克隆抗体。

与传统的单克隆和多克隆抗体相比，重组抗体具有多个优点：

• 批间差异非常低，因此一致性和可重复性高
• 经过抗体工程，灵敏度及特异性增加
• 易于扩展
• 无动物高通量生产

点击了解关于重组抗体及其优势和生产工艺的更多信息。 观看下面的视频，进一步回顾上述三种抗体形式，了解抗体形式的选择如何影响结果一致性。

种属

理论上，待测样本的种属应该与抗体的种属不同。对于 western blot 等使用不含内源性免疫球蛋白（IgG）的细胞裂解液的应用，或者使用直标一抗的实验，您不需要担心这个问题。如果您必须使用和抗体种属相同的样本 (如鼠抗鼠)，我们可以帮助您 修改您的染色实验方案。

关于非模式生物体的说明：

如果您研究的是一个非模式生物样本，您可能需要选用一种未在该种属中检测过的抗体。多数情况下, 蛋白质在几类种属间足够保守，因此，该蛋白可被未经该种属验证的抗体识别。

如果别无选择，我们建议您对免疫原与您感兴趣的蛋白进行序列比对。您可以通过 Swiss - Prot 蛋白数据库链接在线查找相关序列。还有一些网站提供计算相似度百分比的工具，例如多序列比对工具 CLUSTALW.

复制抗体的免疫原序列并将它与您想检测种属的蛋白序列进行比对。比对得分大于 85%，表示抗体可能会发生交叉反应。但即使比对得分大于 85%，我们也无法保证抗体性能。您需要设置多个对照组，确保抗体作用符合预期。

关于免疫原的考虑

抗体由免疫宿主动物产生，且同样是免疫原性物质。免疫原可以是全长蛋白、蛋白片段、多肽、整个生物体（例如细菌）或细胞。供应商提供的数据表通常会提及免疫原。

抗体的免疫原会决定蛋白抗体的结合区域。观看下面的短视频，了解为何应该在挑选抗体前考虑免疫原。

无载体抗体

通常情况下，抗体储存在含有几种关键载体（牛血清白蛋白 (BSA)、甘油和叠氮化钠）的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液中。尽管 BSA 和叠氮化物是维持抗体稳定性和防止抗体污染的必要成分，但这些成分也会妨碍抗体与荧光染料、金属和酶的有效偶联。

BSA 与一抗竞争结合标记物，会大大降低偶联效率。抗体溶液中存在的叠氮化钠可能对细胞有毒害作用，限制了抗体在细胞培养中的使用。因此，如果您想偶联一抗或将它用于活细胞染色，我们推荐您选用无载体形式的抗体，例如无 BSA 抗体及无叠氮化钠抗体。

一抗选择检查表

• 检查一抗的克隆性、应用适用性、宿主种属及种属反应性——这些都可以在供应商数据表中找到
• 查看供应商提供的图片和资料——数据看上去是否可靠？
• 浏览用户评价及近期引用抗体的论文——供应商数据表应该也会提供这些资料，并帮助您了解抗体性能

1.4 直接与间接检测法

对于与目标抗原结合的一抗，可以用直接检测法，也可以用间接检测法检测。

直接检测法将一抗直接与标记物进行偶联。使用间接检测法时，一抗需要与靶向一抗宿主种属的标记二抗结合。间接检测法也可放大和增加信号强度。选用直接检测法还是间接检测法通常取决于靶抗原的表达水平。

选择最适合您实验的方法之前，需考虑这两种方法各自的优点和局限性。

直接检测法与间接检测法

	直接检测法	间接检测法
时间	耗时更短，只需一步标记步骤。	使用偶联二抗，增加了操作步骤，耗时更长。
复杂性	实验方案步骤更少，操作简单。	必须选择合适的二抗（或可用于多重检测的抗体组合），结果复杂。
灵敏度	由于缺少二抗来放大信号，灵敏度似乎弱于间接检测法。	可能有多个二抗结合到一抗上，使得信号放大。
背景	非特异性结合减少。	带有内源性免疫球蛋白的样本可能产生高背景。

如果您想了解有关直接检测法与间接检测法在多种应用（包括细胞成像及流式细胞术）中优势与局限性的更多信息，可以观看 该网络研讨会

1.5 选择二抗

如果您使用的不是直接偶联一抗，那么您将需要选择合适的二抗。

二抗应可靶向一抗的种属和同种型，并通过与一抗的多个位点结合来检测一抗。为您的实验选择二抗时，您需要考虑以下几个方面。

宿主种属
二抗特异性地结合在生成一抗的宿主种属的 IgG 上。例如，如果您的一抗来自兔，那么您需要选择在除兔以外的其他宿主种属中培养的兔二抗（例如驴抗兔二抗）。

抗体种类/亚类
二抗必须抗一抗的同种型。多克隆一抗通常来源于兔、山羊、绵羊或驴，且通常是 IgG 同种型。因此，二抗通常是抗 IgG H&L（重链 & 轻链）抗体。

单克隆一抗通常来源于小鼠、兔和大鼠。例如，若单克隆一抗是小鼠 IgG1，那么您需要使用抗小鼠 IgG 或特异性较弱的抗小鼠 IgG 的 F(ab) 片段。

不同应用中偶联物的选择
为了使目标蛋白可视化，二抗需偶联荧光染料/蛋白、酶或生物素。

• 荧光标签会在特定波长的光激发下发光。有多种激发和发光性质不同的荧光标签可用。
• 酶标记，例如可与合适底物结合产生有色沉淀的辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶 (AP)。
• 生物素标记的抗体应用于亲和素-生物素-酶或荧光复合物（通常缩写为 ABC 试剂）或者亲和素或链霉亲和素结合酶或荧光染料检测法时，可对信号的放大起有效作用。

偶联物的选择取决于实验应用。对于 ELISA 或 western blot 等应用，酶联二抗最受欢迎；但是，对于流式细胞术或免疫荧光法，研究人员更倾向于选择偶联荧光蛋白或 Alexa Fluor® 等荧光染料的二抗。

下面推荐一些适用于您可能使用的几种主要应用的二抗。

二抗	酶	荧光染料
IHC	HRP、HRP 聚合物、生物素（与酶或荧光染料偶联的亲和素/链霉亲和素）	Alexa Fluor®,  Cy® 染料, FITC, PE
ICC	-	Alexa Fluor®, Cy® 染料, FITC, PE
Western blot	HRP, AP	IRDye®, Alexa 680, Alexa 790
ELISA or ELISPOT	HRP、生物素（与酶或荧光染料偶联的亲和素/链霉亲和素）	-
流式细胞术或 FACS	-	Alexa Fluor®, Cy® 染料,  FITC, PE

IHC = 免疫组织化学；ICC = 免疫细胞化学；FACS = 荧光活化细胞分选技术；HRP = 辣根过氧化物酶；AP = 碱性磷酸酶

预吸附二抗
同时使用多种一抗及其相应的二抗进行多色实验时，预吸附二抗是消除种属反应性的理想选择。预吸附（又名交叉吸附）是为提高抗体特异性而引入的额外纯化步骤，其可降低二抗与细胞和组织样本中内源性免疫球蛋白发生交叉反应的风险。

F(ab) 片段抗体
F(ab) 和 (Fab')2 片段二抗可避免抗体的 Fc 部分与细胞（例如巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞、NK 细胞和 B 细胞）上的 Fc 受体之间发生非特异性结合，而且这种抗体尺寸较小，能够更有效地渗入组织。

二抗选择小贴士

小结

以上就是第 1 部分的内容。现在您已做好准备，可以为您下一次的实验选择合适的抗体。

在 第 2 部分，您将了解储存与处理抗体的所有信息。

您将了解到以下信息：                   
• 如何正确储存及处理您的抗体，包括冻存与分装
• 偶联抗体的具体储存条件
• 抗体储存及处理常见问题解答

此外，我们还将解答最重要的问题：“求助！抗体在实验台上放置过夜后 —— 还能用吗？”

现在开始学习 第 2 部分 吧!