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荧光成像培训
第 4 部分：ICC 与 IHC 疑难解答
影响免疫细胞化学（ICC）或免疫组织化学（IHC）实验的因素有很多。为了帮助您快速找到问题的原因，让试验重回正轨，我们收集了常见问题（FAQ）及疑难解答指南。概述
4.1 ICC 与 IHC 疑难解答
4.2 疑难解答视频指南
4.3 IHC 常见问题4.1 ICC 与 IHC 疑难解答
关于 IHC，为了确保您在首次实验中就能得到想要的数据，我们推荐您使用我们的优化试剂盒及试剂：
• 热诱导及酶抗原修复缓冲液
• 高灵敏度标记链霉亲和素-生物素（LSAB）试剂盒及微聚合物试剂盒用于 IHC 检测及信号放大（对于在小鼠样本上使用的小鼠抗体，推荐使用我们的小鼠抗小鼠试剂盒）
• 生物素及微聚合物偶联二抗，构建您自己的 ABC 法
• 用于封闭的优化正常血清
您也可以尝试以下技巧：无染色
一抗和二抗不匹配
使用针对一抗的二抗（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。确保一抗和二抗的同种型匹配（例如，IgY 和 IgG）。
与目标蛋白结合的一抗不足
增加抗体浓度，延长在 4℃ 下的孵育时间（例如，过夜孵育）。
抗体的天然 3D 形态受损不适用于 IHC
查看抗体数据表，确认抗体是否经过 IHC 验证以及经验证的 IHC 类型（福尔马林/PFA 固定、新鲜冷冻切片等）。
用天然（非变性的）western blot 法检测抗体，确保抗体未受损。
由于不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效
使用阳性对照来确认一抗/二抗的有效性（查看“使用阳性对照”部分，了解有关对照的更多信息）。
靶组织中不存在目标组织
加入抗体供应商推荐的阳性对照（查看“使用阳性对照”部分，了解更多信息）。
组织中目标蛋白的丰度不够
使用信号放大操作。例如，使用生物素偶联二抗和偶联链霉亲和素。
二抗未避光储存（适用于检测系统是免疫荧光的情况）
避免将荧光偶联二抗暴露在光照下。
脱蜡不充分
延长切片的脱蜡时间，使用新配制的二甲苯。
固定过程（使用福尔马林和多聚甲醛固定剂）可能改变了抗体识别的表位
使用不同的抗原修复方法来暴露抗原表位（包括使用 pH 值为 6 或 9 的缓冲液进行热介导的表位修复、酶法等）。
缩短切片固定时间。
靶蛋白位于细胞核内，抗体无法穿透核膜
向封闭缓冲液和抗体稀释缓冲液中加入强通透剂，例如 Triton X。查看我们的通透技术实验方案。
PBS 缓冲液被细菌污染，破坏了目标蛋白上的磷酸基团
在 PBS 抗体储备缓冲液中加入 0.01% 叠氮化物或使用新配制的无菌 PBS。高背景
没有封闭非特异性结合或封闭不充分
延长封闭时间，并考虑更换封闭剂。Abcam 推荐使用来自二抗物种的 10% 正常血清封闭 1 小时，或使用 1% - 5% BSA 封闭培养细胞 30 分钟。
另一种方法是尝试使用针对样本物种 Ig 进行预吸附处理的二抗。
一抗浓度可能过高
将抗体滴定到最佳浓度，进一步稀释抗体并在 4℃ 下孵育（缓慢但准确地结合效果最佳）。
孵育温度可能过高4°C 孵育切片或细胞。
二抗可能发生非特异性结合
不加一抗，做二抗对照。
如果观察到仅使用二抗的对照有染色，则更换二抗或使用针对样本物种 Ig 进行预吸附处理的二抗。
组织洗涤不充分，仍含有固定剂各个步骤之间用 PBS 充分洗涤组织。内源过氧化物酶有活性
用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑（2 mM），或抑制过氧化物酶的 H2O2（0.3% v/v）。
固定过程（使用福尔马林或多聚甲醛固定剂）引起自发荧光（适用于检测系统是免疫荧光的情况）
福尔马林/PFA 通常会在绿光光谱中产生自发荧光，因此可以尝试使用在红色光谱范围内发光的荧光基团。
如果有红外检测系统，可以使用红外频段的荧光基团。
过度扩增（扩增技术）
缩短扩增孵育时间，稀释二抗或扩增试剂盒。
底物过多（酶检测）
进一步稀释底物，缩短底物孵育时间。
色原体与细胞/组织中的 PBS 反应（酶检测）与底物一起孵育之前，使用 Tris 缓冲液洗涤切片，然后在 Tris 缓冲液中洗涤切片/细胞。
通透破坏了细胞膜并去除了膜蛋白（膜蛋白检测）
使用更温和的洗涤剂（例如，用 Tween 20 代替 Triton X）。或去除缓冲液中的通透剂。查看我们的通透技术文章。非特异性染色
一抗/二抗浓度可能过高
降低抗体浓度和或缩短孵育周期。与不表达靶点的细胞或组织的信号强度进行比较。
内源过氧化物酶有活性
用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑 (2 mM)，或抑制过氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。
一抗与被染组织同源（如用鼠一抗测鼠组织）。应用二抗时，二抗与所有同源组织结合
使用与组织非同源的一抗。检测系统使用生物素偶联一抗和偶联链霉亲和素。
切片/细胞变干
保持切片/细胞湿度，切勿变干。
使用阳性对照
为什么需要阳性对照
要验证样本染色，需要使用阳性对照。阳性对照是指已知表达检测蛋白的细胞系或组织切片。即使样本结果为阴性，阳性对照的阳性结果仍可以表明实验程序经过优化且有效。这种方法可以用于验证所有阴性结果的有效性。
如何确定适合用作阳性对照的组织类型或细胞系
首先，查看抗体数据表。抗体数据表通常会推荐阳性对照。始终确保所用组织或细胞系来源于经过测试的物种。
如果抗体数据表未列出阳性对照，我们推荐采取以下措施：
1）检查抗体是否存在任何 Abreviews。客户成功检测过的任何组织、细胞或裂解物均可视为合适的阳性对照。
2）尝试查看数据表上的 Swiss-Prot 或 Omnigene 数据库链接。这些数据库通常会有表达蛋白的组织列表。这些组织也可以被视为合适的阳性对照。
3）检查 GeneCards entry 条目中的蛋白质。该条目通常会为您提供蛋白在各种组织中的相对表达水平。
4) 检查 Human Protein Atlas 中的蛋白质。该数据库包含蛋白在不同组织、癌症和细胞系中的表达结果。
5) 如果您仍然难以找到合适的对照品，我们建议在 PubMed 上进行一次快速的文献检索，查看哪些组织和细胞表达目标蛋白。
使用阴性对照
为什么需要阴性对照
阴性对照是指已知不表达检测蛋白的细胞系或组织切片。使用阴性对照的目的是检查是否存在非特异性结合和假阳性结果。推荐使用敲低（KD）或敲除（KO）组织样本作阴性对照组织。
无一抗对照
无一抗对照是指样本中不添加一抗。这样可以检查是否存在任何非特异性结合或因二抗的非特异性结合造成的假阳性结果。
跟正常实验一样，以同样地方式孵育不含抗体的抗体稀释缓冲液和对照样本。
同型对照
同型对照是与一抗具有相同同种型（IgG2a、IgY 等）、克隆性、偶联物和宿主物种，但在所用样本中不表达的分子所产生的抗体。通常情况下，同型对照使用化合物或非哺乳动物蛋白产生。
使用相同浓度的同型对照抗体和一抗（μg/mL）。这样可以检测样本中的背景水平。
与无一抗对照步骤相似，您可以使用同型对照抗体代替特异性一抗。然后正常使用二抗。
使用转染细胞系作为对照
我们推荐在检测重组蛋白时，添加内源性对照。这应是实验设计的重要部分。
对重组蛋白进行抗体检测时，需要考虑一些固有问题：
• 重组蛋白的折叠可能不同于内源蛋白的天然构造。这种折叠可能会阻碍抗体接近表位。标签蛋白通常需要注意这点。
• 始终确保标记位于重组蛋白的 N 端或 C 端。
• 最重要的是，要始终确保重组蛋白包含所用抗体的免疫原序列。
• 内源阳性对照对结果的验证非常重要，了解试剂（例如抗体）和操作的的工作原理也非常重要。
4.2 疑难解答视频指南
如果您想快速找到无染色或高背景等问题的解决办法，下面两个短视频重点介绍了这些问题的主要原因和处理办法。
无信号
高背景
4.3 IHC 常见问题哪种抗原修复方法最适合这种抗体？
抗体数据表会标明有关适当抗原修复方法的信息。如果数据表中没有相关信息，我们建议先用柠檬酸盐缓冲液进行热介导的抗原修复。这一过程通常需要用户进行一定程度的优化。您可能需要优化抗原修复的时间，也可能需要尝试其他可用的方法。有关此抗原修复方法和其他抗原修复方法的更多信息，请访问我们的文章。
哪种细胞通透方法最适合这种抗体？
检测胞内蛋白时，丙酮和甲醇等溶剂适合用于通透；但是，它们与所有抗体都不相容。
Triton 或 NP-40 等去污剂还会溶解部分核膜，因此适用于需要获取核抗原的情况。但是，它们属于强去污剂，尤其在长时间使用的情况下，会对膜蛋白造成破坏，因此不适合检测膜蛋白。
Tween 20、皂素、洋地黄皂苷和 Leucoperm 都是较温和的膜增溶剂。他们可以产生足够大的孔，供抗体通过，而且不会溶解细胞膜。因此适用于检测细胞质中的抗原，或细胞质膜上面向细胞质一面的抗原以及可溶性核抗原。
为什么要封闭内源性过氧化物酶活性？使用 PBS 还是甲醇制备 H2O2 溶液？
内源性过氧化物酶会与基质溶液（过氧化氢和显色剂，例如 DAB）发生反应，导致假阳性。在与 HRP 偶联抗体一起孵育之前，先用过氧化氢预处理样本可以显著降低这种非特异性背景。过氧化氢有时会损害血液涂片和富含过氧化物酶的组织的形态。如果需要保持形态，在甲醇中稀释过氧化氢是最佳选择。
但是，一些细胞表面蛋白标志物对甲醇或过氧化氢淬灭非常敏感，会减少抗原位点的染色，尤其是在冷冻切片上。对于细胞表面蛋白或膜蛋白，建议在 PBS 中使用过氧化氢进行淬灭。另一种实验方案是在一抗孵育步骤之后用过氧化物进行淬灭。
哪种固定方法最适合这种抗体？
固定和通透方法的选择取决于表位和抗体的灵敏度，并且可能需要进行一些优化。固定时可使用一些交联试剂，如多聚甲醛。交联剂可以很好地保护细胞结构，但由于交联可能会阻碍抗体结合，因此交联剂可能会降低某些细胞组分的抗原性（可能需要抗原修复技术）。另一种选择是使用有机溶剂，如甲醇、乙醇和丙酮。但是它们会吸去脂类使细胞脱水。同时会使蛋白沉淀在细胞骨架上。
待测细胞在悬浮液中生长。怎样对这些细胞进行染色？
可以使用 Cytospin™ 离心机将细菌细胞悬液或细胞系悬液旋涂到载玻片上。这一操作会使一小圈细胞样本粘附在载玻片中心，用来干燥、固定和染色。
荧光染料的激发和发射波长是多少？
点击查看荧光染料清单及其激发和发射波长。
可以进行双重染色/三重染色吗？如果可以，需要考虑什么？
要检测同一样本中两种（或多种）不同抗原的共分布情况，可以进行双重或三重 IF 或 IHC 试验。可以（在混合物中）平行使用或按顺序使用靶向两种或三种不同靶蛋白的一抗。
使用预先优化好的试剂盒节省时间
我们建议使用我们的双重染色和三重染色 IHC 检测试剂盒，让您获得无忧体验。
您也可以参考下面的一些重要提示：
1.一抗必须在不同种属中培养，以确保二抗可以单独对每种一抗进行检测。
2.使用的每种二抗都应与不同的荧光染料或显色化学品/酶偶联。使用的每种荧光染料都应激发并发射出可检测的波长，且各波长之间的重叠达到最小。使用的显色化学品/酶应分别产生不同的颜色。这样可以确保您能够区分样本中的不同靶蛋白。
我们建议在将它们组合使用之前，分别优化每种抗体的条件。小结
以上就是荧光成像系列培训的全部内容。希望您现在已经清楚地了解如何用您自己的方式处理成像实验中可能遇到的大部分问题。我们会提供针对不同应用的新培训系列，请务必留意 Abcam 的培训页面。