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荧光成像培训
第 2 部分：选择您的抗体
欢迎参加我们的荧光成像系列培训。我们首先将为您介绍成像的基础知识和基本步骤，接着会讲解实验优化、疑难解答和更先进的技术。对于特异性强且灵敏度高的试验，挑选合适的抗体至关重要。本系列培训的第 2 部分包含不同类型的一抗和二抗、不同的染色方法和荧光基团的相关指南，以便您在实验中遇到这些问题时，可以做出最佳选择。
概述
2.1 直接与间接免疫荧光法比较
2.2 选择二抗
2.3 选择偶联物
2.4 选择荧光基团2.1 直接与间接免疫荧光法比较
免疫荧光法（IF）利用抗体将荧光染料（也称为荧光基团或荧光物）标记到特异性靶抗原上。根据荧光基团与一抗还是二抗偶联，IF 方法可分为两类。
1）直接 IF 使用单个抗体，该抗体直接与荧光基团偶联并靶向目的靶点
2）间接 IF 使用两个抗体：使用目标靶点的未偶联一抗，以及与一抗结合的荧光基团偶联二抗
选择最适合您实验的方法之前，需考虑这两种方法各自的优点和局限性。直接检测法与间接检测法
时间 耗时更短，只需一步标记步骤。 使用偶联二抗检测一抗会增加额外的操作步骤，耗时更长。 复杂性 直接 IF 的实验方案步骤较少，更简单。 间接法必须选择合适的二抗（在需要使用多个二抗的多重实验中，这点尤其重要），复杂性增加。 灵敏度 由于缺少二抗来放大信号，灵敏度似乎弱于间接检测法。 可能有多个二抗结合到一抗上，使得信号放大。 背景 非特异性结合减少。 带有内源性免疫球蛋白的样本可能产生高背景。 2.2 选择二抗
二抗在不同于特定抗体类型的种属中培养；在这里特定抗体类型指一抗的同种型，例如兔 IgG。二抗通过与一抗结合，来检测一抗。它们与一抗的结合位点不止一处。为您的实验选择二抗时，您需要考虑以下几个方面。
宿主种属
二抗特异性地结合在生成一抗的宿主种属的 IgG 上。例如，如果您的一抗来自兔，那么您需要选择在除兔以外的其他宿主种属中培养的兔二抗（例如驴抗兔二抗）。
实验步骤
二抗通常是偶联形式的抗体。对于 ELISA 或 western blot 等应用，酶联二抗最常用；但是，对于流式细胞术或免疫荧光法，研究人员更倾向于选择偶联荧光蛋白或荧光染料（如 Alexa Fluor®）的二抗。
抗体种类/亚类
二抗必须抗一抗的同种型。多克隆一抗通常来源于兔、山羊、绵羊或驴，且通常是 IgG 同种型。因此，二抗通常是 IgG H&L（重链 & 轻链）抗体。
单克隆一抗通常来源于小鼠、兔和大鼠。例如，如果单克隆一抗是小鼠 IgG1，那么您需要使用抗小鼠 IgG 抗体或特异性较弱的抗小鼠 IgG F(ab) 片段。
种类或同种型： IgG (γ 重链), IgM (α), IgE, IgD (δ)
亚类： IgG1 (γ1 重链), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2
分型： κ 轻链, λ 轻链
亚型： λ1, λ2, λ3, λ4
预吸附二抗
同时使用多种一抗及其相应的二抗进行多色实验时，预吸附二抗是消除种属反应性的理想选择。预吸附（又名交叉吸附）是为提高抗体特异性而引入的额外纯化步骤，可降低二抗与细胞和组织样本中内源性免疫球蛋白发生交叉反应的风险。
F(ab) 片段抗体
F(ab) 和 (Fab')2 片段二抗 可避免抗体的 Fc 部分与细胞（例如巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞、NK 细胞和 B 细胞）上的 Fc 受体发生非特异性结合，而且这种抗体尺寸较小，能够更有效地渗入组织。如需了解有关如何选择合适二抗的更多信息，请点击获取完整指南。2.3 选择偶联物
二抗可与酶、生物素和荧光染料/蛋白偶联。偶联物的选择取决于实验应用，但应确保可以在细胞成像、免疫组化、流式细胞术及 western blot 应用中对一抗进行比色法、荧光法或化学发光法检测。
对冷冻样本（IHC - Fr）进行细胞成像、流式细胞术及免疫组化时，您通常需要荧光偶联物。如上所述，使用荧光偶联二抗可以放大一抗信号。
了解不同抗体偶联物之间的差异，以及如何选择最适合您应用的抗体偶联物。2.4 选择荧光基团
对于多色实验而言，了解实验中的荧光基团相当重要。在下面的短视频中，您将了解到荧光基团的光谱、发射及吸收基团。
点击下载我们的荧光染料表，其中包括
– 30 种常用流式细胞术荧光染料（包括串联染料）的发射和激发荧光光谱
– 整个荧光光谱范围内最常用的一些激光器和滤光片
– 每种荧光染料的荧光通道和相对亮度
小结这就是第 2 部分的内容。现在，您已经可以更好地进行以下操作：
– 在间接染色法与直接染色法中进行选择
– 选择合适的二抗
– 选择合适的荧光基团或用于多重检测的多种荧光基团
在第 3 部分，我们将介绍 ICC 和 IHC 实验方案、样本制备、免疫染色及封片，同时还会概述荧光染色步骤及多个抗原的染色技巧。