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IHC 培训
第 4 部分：疑难解答
欢迎参加我们的免疫组化（IHC）系列培训。我们将首先介绍样本制备和抗体选择等基础知识，然后再带您了解免疫染色实验方案及疑难解答。在本次 IHC 培训的最后部分，我们将与您分享一些常见问题的疑难解答提示，之后再介绍一些实用的试剂使你避免使用疑难解答。
第 4 部分 概述4.1 无染色
4.2 高背景
4.3 错误染色
4.4 有助于解决 IHC 实验问题的实用试剂
4.5 IHC 常见问题
4.1 无染色您在 IHC 中可能遇到的主要问题之一是无染色。导致这一问题的主要原因有 3 个：
1. 蛋白低表达或不表达
2. 组织制备不当
3. 试剂/实验方案有问题
以下短视频介绍了如何纠正这些问题。
低表达或不表达
样本制备不当
试剂/实验方案有问题
4.2 高背景IHC 染色的另一个常见问题是高背景。下面的短视频强调了产生高背景的主要原因，以及如何解决这些问题。
4.3 错误染色如需了解 IHC 的第 3 个常见问题 —— 错误染色，请观看下面的短视频
获取 IHC 疑难解答提示的完整指南，了解更多疑难解答。
4.4 有助于解决 IHC 实验问题的实用试剂为帮助您进行 IHC 实验，我们开发了特殊的产品，能减少您需要处理的问题数量。
• 我们的重组 RabMAb® 抗体在未损失特异性的前提下提高了灵敏度和批间一致性，非常适用于要求高的应用，例如石蜡包埋组织的 IHC 实验。此外，它们还是小鼠模型用户的理想试剂。
查看关于重组 RabMAb® 抗体的更多优势。
• 如果您需要在小鼠组织上使用小鼠单克隆抗体，这里有几点提示帮助您消除背景染色。
查看我们的小鼠抗小鼠（MOM）染色实验方案。
• 您可能还想了解可以使用哪些二抗。使用 HRP 聚合物二抗，可以消除 IHC 实验的内源性生物素背景。此外，HRP 聚合物二抗使用微聚合物技术形成微小的检测复合物，从而具备更好的组织穿透性和灵敏度，因此可用于检测低表达蛋白。此外，相较于标准 HRP 二抗，HRP 聚合物二抗能结合更多辣根过氧化物酶，从而增强信号。
为您的 IHC 染色寻找合适的二抗。
• 如果您是 IHC 新手，我们建议您选用经过优化的试剂盒及试剂，确保在首次实验中即可得到您需要的数据。
寻找合适的 IHC 试剂盒和试剂。
4.5 IHC 常见问题哪种抗原修复方法最适合这种抗体？
抗体说明书会说明有关合适抗原修复方法的所有信息。如果说明书中没有相关信息，我们建议先用柠檬酸盐缓冲液进行热介导的抗原修复。这一过程通常需要终端用户进行一定程度的优化。您可能需要优化抗原修复的时间，也可能需要尝试其他可用的方法。有关此种抗原修复方法和其他抗原修复方法的更多信息，请访问我们的文章。
哪种细胞通透方法最适合这种抗体？
检测胞内蛋白时，丙酮和甲醇等溶剂适用于透化；但是，它们并非与所有抗体都相容。
Triton 或 NP-40 等去污剂还会溶解部分核膜，因此适用于需要接触核抗原的情况。但是，它们属于强去污剂，尤其在长时间遗留的情况下，能够对膜蛋白造成破坏，因此不适用于检测膜蛋白。
Tween 20、皂素（Saponin）、毛地黄皂苷（Digitonin）和 Leucoperm 都是较温和的膜增溶剂。它们可以制造足够大的孔道，供抗体通过，但不会溶解细胞质膜。它们适用于检测细胞质中的抗原，或质膜胞质面的抗原和可溶性核抗原。
为什么要封闭内源性过氧化物酶活性？使用 PBS 还是甲醇制备 H2O2 溶液？
内源性过氧化物酶会与底物溶液（过氧化氢和色原体，例如 DAB）发生反应，导致假阳性。在与 HRP 偶联抗体孵育之前，先用过氧化氢预处理样本可以显著降低这种非特异性背景。过氧化氢有时会损害血液涂片和富含过氧化物酶的组织的形态。如果需要保持易损样本的形态，在甲醇中稀释过氧化氢是最佳选择。
但是，一些细胞表面蛋白标志物对甲醇或过氧化氢淬灭非常敏感，甲醇或过氧化氢处理会减少抗原位点的染色，尤其是对于冷冻切片而言。对于细胞表面或膜蛋白，建议在 PBS 中使用过氧化氢进行淬灭。还有一种实验方案改进是，先用一抗孵育切片或细胞，再用过氧化物进行淬灭。
哪种固定方法最适合这种抗体？
固定和通透方法的选择取决于表位和抗体的灵敏度，并且可能需要进行一些优化。固定时可使用交联试剂，如多聚甲醛。交联剂可以很好地保护细胞结构，但由于交联可能会阻碍抗体结合，因此交联剂可能会降低某些细胞组分的抗原性（可能需要抗原修复技术）。另一种选择是使用有机溶剂，如甲醇、乙醇和丙酮。但是这些溶剂在去除脂类的同时会使细胞脱水。还会在细胞结构上析出蛋白。
待测细胞悬浮生长。怎样对这些细胞进行染色？
可以使用 Cytospin™ 离心机将细菌细胞悬液或细胞系悬液旋涂到载玻片上。这一操作可以将一小圈细胞样本粘附在载玻片中心，用来干燥、固定和染色。
荧光染料的激发和发射波长是多少？
查看荧光染料清单及其激发和发射波长。点击查看荧光染料清单及其激发和发射波长。
可以进行双重染色/三重染色吗？如果可以，需要考虑什么？
要检测同一样本中两种（或多种）不同抗原的共分布情况，可以进行双重或三重 IHC 试验。可以（在混合物中）平行使用或按顺序使用靶向两种或三种不同靶蛋白的一抗。
建议使用我们预先优化好的双重染色和三重染色 IHC 检测试剂盒，获得无忧体验。
您也可以根据以下多色 IHC 重要提示自行制备：
1. 一抗必须来源于不同种属，以确保单独的二抗可以检测每种一抗。
2. 使用的每种二抗都应与不同的荧光染料或显色化学品/酶偶联。使用的每种荧光染料都应激发并发射出可检测的波长，且各波长之间的重叠达到最小。使用的显色化学品/酶应分别产生不同的颜色。这样可以确保您能够区分样本中的不同靶蛋白。
我们建议在使用各类抗体组合之前，分别优化每种抗体的条件。
小结以上就是 IHC 系列培训的全部内容。我们希望您已准备充分，有能力进行下一次的 IHC 实验并获得清晰准确的 IHC 图像。您已了解了 IHC 实验的常见误区，您很有可能避开这些问题，希望您不会用到我们的疑难解答指南。
如果您已准备就绪，可以参加我们的 IHC 小测试，以检验您对新知识的掌握程度。
此外，请密切关注我们的主培训页面，以便您复习或掌握实验室中的其他常见应用。