IHC 培训

第 1 部分：基础知识

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欢迎参加我们的免疫组化（IHC）系列培训。我们将首先介绍样本制备和抗体选择等基础知识，然后再带您了解免疫染色实验方案及疑难解答。

在 IHC 培训的第 1 部分，我们将为您展示如何拥有一个完美的实验开端。能否成功制备样本将成为决定最终数据质量的重要因素。在这一部分培训中，我们将带您了解完成 IHC 样本制备及处理的最优过程中的主要步骤。

第 1 部分 概述

1.1 什么是免疫组化？
1.2 样本规格
1.3 固定
1.4 包埋和切片

1.1 什么是免疫组化？

免疫组化（IHC）是一种利用抗体-抗原的相互作用来显示组织切片中抗原分布和定位的方法。

IHC 常用于诊断肿瘤等疾病中的组织异常。通常，IHC 可以为通过其它方法得到的数据提供有价值的观点与支撑，进而更全面地理解这些数据。

IHC 染色需借助识别靶抗原的抗体完成。您可以通过显色或荧光检测系统对抗体-抗原相互作用进行可视化。在显色检测中，抗体与酶偶联，这种酶在接触到色原体时会产生有色沉淀。在荧光检测中，抗体与荧光基团偶联。

以下短视频介绍了 IHC 的主要原理。

1.2 样本制备

在 IHC 过程中，样本制备是获得高质量染色的关键。样本制备包括固定、包埋和切片等步骤。

IHC 组织保存主要有两种方法，一种对福尔马林固定组织进行石蜡包埋，另一种是冷冻。以下视频介绍了两种方法的区别及其各自的优点与局限性。

查看以下指南，快速了解 IHC 石蜡包埋切片与冷冻切片的主要区别。

	IHC - 石蜡包埋切片	IHC - 冷冻切片
切片厚度	3–4 µm	4–10 µm
固定	常用 10% 中性福尔马林缓冲液（NBF）	多聚甲醛、甲醇、乙醇或丙酮
	预包埋	切片前或切片后
切片	切片机	冷冻切片机
储存	室温下可储存多年（抗原可能随时间推移发生改变）	-80℃ 下可储存 1 年（-190℃ 下储存时间更长）。
优点	在组织形态保留和抗原性保留方面能实现最佳平衡	抗原状态更“天然”
	非常稳定，且容易处理	适用于不耐受标准乙醛固定和石蜡处理的抗原
		用于磷酸化表位
缺点	过度固定（超过 24 小时）会掩盖表位	一旦形成冰晶，组织形态会比石蜡切片差
	免疫染色前需要脱蜡	切片较厚，可能导致分辨率低和图像质量差
	如果用交联试剂（乙醛）固定，需要进行抗原修复	样本易碎

1.3 固定

固定步骤在固定抗原的同时保留细胞和亚细胞结构。固定还可以防止离体组织发生自溶和坏死，保留抗原性，有助于在组织处理过程中保留细胞成分。

固定方法的选择取决于表位的敏感度，并且可能需要进行一些优化。以下视频详细介绍了 IHC 标准固定法。

每种抗原类型的的标准化固定剂对于可重复性染色都是必不可少的 —— 固定不当的抗原可能无法检测。

以下是关于固定剂选择的建议：

• 大多数低分子量的蛋白质、肽和酶：细胞/细胞学制备样品：4% 甲醛；组织切片：10% 中性福尔马林缓冲液（NBF）
• 精细组织：Bouin 固定剂
• 氨基酸等小分子：4% 甲醛
• 造血器官（如肝、脾、骨髓）：Zenker 溶液
• 结缔组织：Helly 溶液
• 核酸：Carnoy 溶液
• 大分子蛋白抗原（如免疫球蛋白）：预冷丙酮或甲醇 (100%)
• 核形态：锌福尔马林
• 电子显微镜成像：4% 甲醛，1% 戊二醛

获取固定实验方案。

1.4 包埋和切片

组织固定后需立即处理，确保组织可以被切成厚度通常为 4 - 10 µm 的切片。用乙醛固定组织后，对组织进行脱水、透明及石蜡包埋，石蜡是一种有利于组织处理及之后切片的介质。也可以将未固定得组织放在液氮中速冻，并用诸如 OCT（optimal cutting temperature compound）等介质包埋。在这种情况下，组织在切片前可能需短暂固定。下面的实验方案涉及：

• 石蜡包埋组织的处理
• 冷冻组织包埋
• 乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA）包埋

获取组织处理实验方案。

以下视频介绍了石蜡切片的包埋和切片。

石蜡包埋组织切片视频方案

小结

我们希望，您现在已经具备良好的前期基础，可以开始计划您的 IHC 实验。您应该对样本制备有了更好的理解，尤其是：

• IHC 组织保存的两种主要方法
• 组织固定及包埋方法

在第 2 部分，我们将介绍免疫染色实验方案的步骤，例如抗原修复、通透、封闭、一抗与二抗的选择及检测系统。

现在开始学习第 2 部分吧！