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ChIP 培训
第 4 部分：优化和疑难解答
欢迎参加我们的染色质免疫沉淀 (ChIP) 系列培训课程。我们将首先为您介绍 ChIP 基础知识和基本方案，接着会讲解实验优化、疑难解答和更高级的技术。在第 4 部分的 ChIP 系列培训课程中，我们将带您了解优化和疑难解答提示，以便您充分利用 ChIP 实验。接着，我们会解答一些关于 ChIP 的常见问题（FAQ）。最后，我们将分享一些基于少量细胞进行 ChIP 实验的技巧。
第 4 部分 概述4.1 优化您的 ChIP 实验方案
4.2 疑难解答
4.3 ChIP 技巧与常见问题
4.4 基于少量细胞进行 ChIP
4.1 优化您的 ChIP 实验方案选择合适的 ChIP 级抗体对您成功地进行 ChIP 实验而言至关重要。并不是所有的抗体都适合 ChIP 实验，甚至很多抗体不符合 ChIP 质量要求或未经过 ChIP 应用验证。同样地，添加合适的对照可确保实验按照预期进行。
为了尽可能获取最佳结果，您可能需要修改您的实验方案或者更换您的试剂。以下是一些可能需要优化的内容：交联、染色质片段化、抗体浓度及洗涤缓冲液的强度。
以下视频介绍了如何挑选合适的抗体、如何优化染色质制备以及如何选择合适的对照。
为 ChIP 选择抗体时，请留意抗体的克隆性（即多克隆还是单克隆）。重组单克隆抗体对靶点的特异性高，非特异性交叉反应性低，批间差异最小。
观看以下视频，了解如何利用单克隆抗体在 ChIP 实验中实现可重复性。
4.2 疑难解答所有的实验和模型系统都是不同的，因此有时候只遵循标准实验方案是无法得到预期结果的。如果您的 ChIP 实验无法获得预期的结果，不妨尝试一下我们的疑难解答提示。以下视频解答了常见问题，例如非特异性抗体对照产生高背景、大片区域出现高背景且分辨率低、信号弱及 PCR 放大等。
4.3 ChIP 技巧与常见问题现在，您已经学习了 ChIP 实验的所有主要步骤，并且了解了如何优化实验方案，所以您应该已经十分清楚如何才能获得好的结果。在此，我们将与您分享一些关于 ChIP 实验方案不同步骤的操作技巧，包括交联、染色质片段化及检测。
ChIP 实验成功的实用技巧：
• 如果您的实验室在 ChIP 技术方面还不成熟，您可以考虑使用试剂盒。Abcam 的 ChIP 试剂盒采用了新的结合技术，可以省去抗体与微珠过夜结合的标准步骤，确保您在 5 小时内完成 ChIP 实验。
• 始终执行时程实验，以优化交联条件。样本的建议交联时间为 2 - 30 分钟。加入甘氨酸淬灭甲醛，终止交联反应。
• 每进行一次实验，必须按照时程实验进行染色质片段化步骤。
• 记住，酶切不会产生随机染色质片段。微球菌核酸酶对基因组序列的某些区域有倾向性，会造成 DNA 的消化不均匀或不相同。结果可能不完全准确，因为某些位点可能被过度表达，而且一些数据可能会被遗漏。
• 虽然超声处理最适合 X-ChIP，并且酶消化对充分交联的样本无效，但需要温和或不完全交联时，微球菌核酸酶消化可以起到一定的作用，它与超声处理搭配使用可以提高分辨率。
• 超声处理期间避免起泡，因为起泡会导致溶液内的能量转移减少，并降低超声效率。
• 超声处理的染色质可在液氮中速冻，在 -80℃ 下可保存长达 2 个月。应避免反复冻融。
• 基因组的某些区域会比其他区域纯化得更好，一些核小体在酶促断裂过程中可能发生重排。因此，在起始物料和纯化/ChIPped 物料的几个区域生成 PCR 引物，作为虚假结果的对照变得至关重要。裂解起始细胞，制备起始物料，并取样用于 ChIP 实验平行对照区域的简单 PCR。
• 在起始物料可能发生变化的情况下，应始终对起始物料的量进行标准化，以消除由于样本量不均匀而引入的误差。为了规范化您的数据，取最后物料的扩增子值并将其除以 input 物料的扩增子值。
• 对于组蛋白修饰，除了 input 量可以标准化，相应的组蛋白免疫沉淀量也可以作为标准化参照。例如，通过 H3K4me3 抗体进行的 ChIP 可以用 input 量和组蛋白 H3 的免疫沉淀量标准化。
如果您仍然会遇到一些困难或有任何其他问题，可以查看我们的 ChIP 常见问题清单：
交联还是不交联？
用于组蛋白修饰的 ChIP 通常不需要交联，但 DNA 结合复合物中包含的转录因子和蛋白等非组蛋白可能需要交联。
如何交联？
使用甲醛，因为它形成的连接是可逆的。UV 交联不合适，因为它是不可逆的。其他化学物质，如顺铂，只能用于 DNA 和蛋白质之间的选择性交联。研究 DNA 与异常大分子蛋白/RNA 复合物之间的相互作用时，可能需要使用福尔马林与 EGS（乙二醇双[琥珀酰亚胺基丁二酸]）进行双重交联。
会过度交联吗？
是的。交联是一个对时间要求很严格的过程，通常只能进行几分钟。过度交联会导致多个问题，包括抗原可用性降低、超声处理效率降低。例如，抗原决定簇可能被掩盖或改变，从而影响抗体结合抗原的能力，导致样本中的物料减少。
如何确保消化一致性？
购买原液酶后一定要等量分装，每次做实验时都要用新鲜的分装液进行新的时程实验。虽然存储过程中，酶的质量可能会随着时间的推移发生变化，但染色质制备期间的变化风险（压实度等）更高；新的染色质样本不能被视作与之前其他样本相同的样本。做 N-ChIP 时，应运行 X-ChIP 对照实验，以评估因未交联导致的任何变异性和不必要的变化。
没有 ChIP 级抗体？
如果没有可用的抗体，可以选择在免疫沉淀（IP）和免疫细胞学（ICC）中有效工作的抗体。至于 N-ChIP，推荐使用 western blot 中的多肽竞争来表征抗体特异性。理想情况下，ChIP 的特异性抗体应经过亲和纯化；但是，许多实验室将血清作为抗体来源，然后再克服强效缓冲液可能出现的背景问题。用于组蛋白修饰的抗体需要充分检测特异性，例如通过肽阵列检测。
使用哪些抗体对照？
组蛋白 H3 三甲基 K4（H3K4me3）和三甲基 K9（H3K9me3）分别是研究活性基因和非活性基因常用的阳性对照。请记住，这些抗体本身并不是阳性和阴性对照，对照取决于您正在研究的位点：如果特定目标位点没有 H3K4me3，那么即便是全球最好的 H3K4me3 ChIP 级抗体，也不会免疫沉淀该区域的任何东西，因此，它不是一个合适的阳性对照。
选择阴性对照时，可以使用能够识别非染色质表位的抗体，如 GFP 抗体。染色质重塑可能会移动或移除特定位点的组蛋白，例如活性启动子，因此需使用未修饰组蛋白（如组蛋白 H3）的对照抗体来检查特定基因组位点的核小体保留情况。
分析组蛋白修饰时，需要标准化到组蛋白内容物，例如使用 H3 抗体进行标准化。
抗体对 ChIP 起作用，但信号较弱 —— 如何补救？
首先，您可以尝试不同类型的 ChIP。例如，如果您正在执行 N-ChIP，那么您可以尝试一下 X-ChIP。或者，在不同的位置查看。抗原有可能存在，但不在您观察的基因组位点上。如果可以的话，最好尝试不同的抗体，以找到在 ChIP 中效果最好的抗体。最后，目标表位可能在 X-ChIP 中被掩盖了：可能有必要进一步优化交联时间进程。
ChIP 实验应使用的抗体浓度是多少？
首次试验时，每 25 - 35 mg 纯单体，可使用 3 - 5 µg 抗体。如果您正在做定量 ChIP，您可能需要使用等量的染色质和抗体。与许多技术一样，有必要在开始时优化一抗。
ChIP 应使用什么组蛋白对照样本？
免疫沉淀组蛋白修饰时，纯化的组蛋白 H3 和 H1 可以作为实验组蛋白制备质量的阳性对照（组蛋白 H1 通常用于 X-ChIP）。
推荐使用哪种缓冲液？
缓冲液越强效越好（即缓冲液中盐和去污剂的浓度越高，结果越干净）。由于我们必须在低背景和对靶点的有害影响之间找到平衡，所以必须每次进行新的 ChIP 实验时，均需优化缓冲液。NP-40 可作为去污剂，RIPA 也常用于 X-ChIP。
还有哪些处理可能会影响 ChIP 结果？
添加 TSA、丁酸盐或秋水仙胺一般不会影响 ChIP。一些抗体会受到低浓度 SDS 的影响。请勿在高 rpm（不超过 6,000 rpm）下离心琼脂糖凝胶微珠，否则会压实微珠并损坏微珠。
4.4 基于少量细胞进行 ChIP标准 ChIP 工作流程需要大量的细胞。起始物料大约需要 106 - 107 个细胞，低于该细胞量时，由于高背景结合、低富集效率和富集文库复杂性丧失，检测会受阻。但是，获得这么大的样本量很难，特别是在检查像转基因小鼠组织或临床样本这种珍贵的样本类型时。我们可以应用一些策略解决样本 input 量少的问题。
1.提高富集效率，最大限度地减少样本损失
对 ChIP 工作流程作出一些调整可以提高富集效率，并最大限度地减少低 input 样本的样本损失。
• 着重考虑样本本身的质量和属性。具体来说，在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中，过度交联会引发一些问题。您可能需要从 FFPE 样本中提取可溶性染色质。
• 调节缓冲液 pH 值、离子强度和孵育时间等变量可优化低浓度抗原 IP 的动力学。
• DNA 片段大小范围太广会妨碍低 input ChIP 的分析，可通过限制超声处理次数和/或 MNase 消化进行补救，确保片段更均匀。
• 虽然有时会将细菌 DNA 用作封闭剂来降低标准 ChIP 的背景，但不建议将其用于低 input ChIP，因为它会混入整个检测并干扰数据分析。其他封闭剂如惰性蛋白或 mRNA 可以减少低 input ChIP 中的背景结合，同时不污染数据。
• 将检测试剂盒小型化为微孔板形式可有利于自动化，并在 IP 工作流程中提高抗原浓度（如靶转录因子）—— 这样可以避免因抗原浓度低导致的“稀释效应”，“稀释效应”会导致抗体–抗原复合物解离及 ChIP 效率降低。
• 您可以采用单管检测形式，并在每个检测步骤完成后进行磁珠纯化而不是基于酚进行提取，从而最大限度地保留样本。
• 抗体的固定和去除非抗体结合物质的洗涤往往被忽视。标准方案使用蛋白 A/G，但像表位标记蛋白这样的替代品可能存在过度表达和引入伪影的风险。
• 市场上已有高灵敏度的 ChIP 试剂盒，可用于少量细胞的检测。
2. 读数和下游数据处理平台
除检测本身外，下游处理（即测序、阵列或 PCR）和生物信息学分析的选择与优化同样重要。
• 检测平台也会影响检测试剂盒的灵敏度。ChIP-seq 是高灵敏度的金标准平台，其噪音始终低于 ChIP-on-chip。
• 低 input ChIP-seq 实施过程中最常见的问题在于存在大量不可定位的读段、PCR 重复序列并且文库复杂性低。因此，必须通过优化接头连接对低 input 样本的文库制备进行优化，避免扩增产生的误差和偏倚。如上所述，最大限度地提高 ChIP 的富集效率也会有所帮助。
• 应调整生物信息学工作流程，以考虑数据中可能存在的流程偏差。
小结您现在应该已经完全具备了处理 ChIP 实验的能力。您也更好地理解了：
• 如何为成功进行 ChIP 实验挑选合适的抗体和对照
• 如何优化您的 ChIP 实验方案
• 从哪里寻求帮助和疑难解答提示
• 细胞数量少时，如何优化 ChIP 实验流程
以上就是本次课程的全部内容了。希望您喜欢本次培训，并且已有能力充分利用您的 ChIP 实验。
如果您已准备就绪，可以参加我们的 ChIP 小测试，以检验您对新知识的掌握程度。
我们会提供针对不同应用的新培训系列，请务必留意Abcam 的培训页面。