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  • ChIP 培训
    第 2 部分：实验方案


    欢迎参加我们的染色质免疫沉淀 (ChIP) 系列培训课程。我们将首先为您介绍 ChIP 基础知识和基本方案，接着会讲解实验优化、疑难解答和更高级的技术。

    在第 2 部分的 ChIP 系列培训课程中，我们将为您介绍交联 ChIP 和自然 ChIP 的实验方案。此外，我们还会介绍一些有用的染色质制备方案，便于您使用组织和植物样本进行 ChIP。


    第 2 部分 概述

    2.1 ChIP 实验方案概述
    2.2 交联 ChIP 与自然 ChIP 实验方案
    2.3 组织制备染色质
    2.4 植物样本制备染色质


    2.1 ChIP 实验方案概述

    我们已经在第 1 部分介绍过，ChIP 是指利用抗体免疫沉淀目的蛋白，例如转录因子，以及其结合的 DNA。然后回收相关 DNA，并通过 PCR、微阵列或测序进行分析 DNA，以确定基因组序列和蛋白结合位置。

    您可以使用两种主要的 ChIP 类型：

    1）交联 ChIP（X-ChIP）—— 可用于任何蛋白，但分析与 DNA 弱结合的蛋白时必须用交联 ChIP
    2）自然 ChIP（N-ChIP）—— 通常用于分析组蛋白修饰

    下面我们将详细介绍这两种方法的实验方案。两种方法的实验方案整体非常相似：获取一个染色质样本，切成片段。接下来，您可以使用靶向目的蛋白或组蛋白修饰的特异性抗体孵育染色质片段。最后，使用 qPCR 或 ChIP-seq 分析下拉的 DNA。以下视频介绍了 ChIP 实验方案的所有步骤。


    图 1 是 ChIP 实验流程的分步图解。


    图 1. ChIP 实验方案流程。ChIP 实验分步流程，其中：1 - 交联；2 - 染色质片段化；3 - 免疫沉淀；4 - DNA 回收和纯化；5 - DNA 分析。


    2.2 交联 ChIP（X-ChIP）与自然 ChIP（N-ChIP）实验方案

    现在，您已经很好地了解了 ChIP 实验的预期结果，接下来我们将介绍两种主要的实验方案。X-ChIP 与 N-ChIP 实验方案的区别在于染色质的制备，包括交联和染色质片段化步骤。X-ChIP 需要交联，例如福尔马林处理，以便将靶抗原固定到其染色质结合位点上。但是，组蛋白一般不需要交联，因为它们已经与 DNA 紧密相连。因此，N-ChIP 实验方案通常用于组蛋白及其修饰，不需要任何交联步骤。

    转录因子和DNA 结合复合物中所含的蛋白等非组蛋白成分很可能需要交联。请记住，目标蛋白距离DNA 越远，无交联的 ChIP 效率就越低。

    N-ChIP 和 X-ChIP 都需要通过染色质片段化来使目标蛋白容易被抗体接近，但它们分别使用微球菌核酸酶或超声处理来进行片段化过程。

    以下视频介绍了 N-ChIP 和 X-ChIP 的利弊，有助于您选择合适的方法。


    双重交联 ChIP（双重 X-ChIP）法可以将染色质样本中的转录因子高效结合到 DNA 上。采用 ChIP 观察与 DNA 直接结合的转录因子乃至未与 DNA直接结合的复合体的结合模式时，此类双重交联法非常有效。双重 X-ChIP 实验方案使用福尔马林和 EGS（乙二醇双[琥珀酰亚胺基丁二酸]）将蛋白双重交联到 DNA 上并捕获蛋白间相互作用。

    确定最合适的方法后，您可以查看我们的详细 X-ChIP, dual-X-ChIP, 或 N-ChIP 实验方案。


    2.3 从组织中制备染色质

    检查特定组织中的表观遗传机制可以揭示组织特异性遗传编程、发育和生物过程的基本要素。ChIP 是检测组织特异性转录因子、基因活化和表观遗传调控其他方面的作用和机制的有效工具。

    从组织中提取染色质可能比使用细胞悬液更棘手。根据您使用的组织类型，您可能需要对实验方案的染色质制备步骤进行优化。优化实验方案时，您需要考虑到您所需组织的确切数量取决于蛋白质丰度、抗体亲和力和交联效率。以下实验方案在每次 ChIP 测定使用 5-15 μg 染色质的实验中经过优化，，每次 ChIP 大概准备 30 mg 肝组织。开始 X-ChIP 检测之前，应确定每种组织类型的确切染色质浓度。

    下载我们的组织样本染色质制备方案，助您展开研究。


    2.4 植物样本制备染色质

    与动物细胞相比，植物细胞拥有坚硬的细胞壁，给针对动物建立的实验方案造成了一定的限制。本实验方案介绍了如何通过模式植物拟南芥制备染色质。从植物中获得优良的染色质样本后，即可使用上述标准 X-ChIP 实验方案。

    点击下载完整的实验方案。


    小结

    现在，您应该对您的 ChIP 实验所需的不同 ChIP 实验方案和染色质提取方法有了更好的了解。以下是简要纲要：

    • 使用 X-ChIP 分析与 DNA 弱结合的蛋白
    • 使用 N-ChIP 分析天然组蛋白修饰
    • 处理组织时优化您的染色质提取步骤
    • 从植物细胞中提取染色质，由于其细胞壁坚硬，将需要额外的步骤

    在第 3 部分，我们将为您介绍 ChIP 数据分析，包括质量检查、定位以及热图生成和基因本体论术语。

    现在开始学习第 3 部分吧！