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  • ChIP 培训
    第 1 部分：基础知识


    欢迎参加我们的染色质免疫沉淀 (ChIP) 系列培训课程。我们将首先为您介绍 ChIP 基础知识和基本方案，接着会讲解实验优化、疑难解答和更高级的技术。

    在第 1 部分的 ChIP 系列课程中，我们将为您介绍这一强大技术的基础知识、背景及潜在用途。在开始实验之前，请熟悉一下方法背后的知识点。


    第 1 部分 概述

    1.1 什么是 ChIP？
    1.2 染色质结构与功能
    1.3 何时使用 ChIP 技术
    1.4 基于 ChIP 的先进方法


    1.1 什么是 ChIP？

    ChIP 是一项可以帮助您定位与基因组内特定区域结合的蛋白质的技术。因此，ChIP 有助于研究人员检测表观遗传学调控因子与 DNA 在自然条件下的相互作用。

    ChIP 的核心原理是利用一种靶向目的蛋白的抗体，下拉与之结合的 DNA 区域。您可以使用目标蛋白（例如转录因子）的特异性抗体选择性地富集染色质组分。富集目的蛋白后，可以使用下拉技术分离蛋白相互作用的 DNA 区域。然后，您可以对下拉的 DNA 进行测序（ChIP-seq）或将其用于 qPCR（ChIP-PCR），以确定目的蛋白在基因组中的结合位点。

    以下视频介绍了 ChIP 技术的作用。


    利用 ChIP，研究人员可以在整个基因组内识别与目的蛋白结合的特定基因和序列，为其调控基因的功能和机制提供关键线索。通过解析蛋白质-DNA 相互作用的时间、空间动态特征，ChIP 可以帮助我们了解重要的生物学过程和疾病病理学。


    1.2 染色质结构与功能

    染色质由组蛋白和 DNA 组成。DNA 缠绕在八个核心组蛋白周围，形成基本的染色质单元，即核小体。核小体像珠串一样串连在一起，并被包装成高阶染色质结构（图 1）。

    染色质的功能是将 DNA 高效包装成小体积以适应细胞的细胞核，并保护 DNA 结构和序列。将 DNA 包装成染色质有利于有丝分裂和减数分裂，防止染色体断裂，并控制基因表达和 DNA 复制。

    染色质主要有两种：

    1）异染色质 —— 染色质排列紧密，可使基因表达沉默
    2）常染色质 —— 染色质聚集松散，可实现活性基因转录


    图 1. 染色质结构。DNA 缠绕在核小体周围，形成染色质纤维，然后再形成染色体。

    为了改变基因表达和细胞编程，染色质在例如不同的发育阶段下或响应特定的刺激时处于不断被重塑的动态中，。大的基因组区域可能被沉默或激活，或者核小体可能被打开，以便提高特定的基因或 DNA 序列的可及性。了解在不同的细胞或疾病状态下，基因组中的哪些区域是活跃的或是不活跃的，有助于确定关键通路和相关基因。

    点击查看染色质可及性和相互作用的研究方法。


    1.3 何时使用 ChIP 技术

    ChIP 是研究染色质修饰的首选技术。您可以使用 ChIP 来解析染色质与其相关因子相互作用的时空动态。通常，ChIP 被用于检测整个基因组中组蛋白修饰或 DNA 结合蛋白（比如转录因子）与基因组结合的模式。

    组蛋白修饰

    从核小体核心伸出的组蛋白尾巴可以被靶向修饰。不同的修饰会对染色质构象和基因表达产生不同的影响。因此，普遍做法是将在修饰相关的研究时应用 ChIP 技术，为您获取更清晰的目的基因周围染色质景观图像。某些组蛋白修饰还与不同的基因调控区域如增强子或启动子相关。

    组蛋白 H3 是最常被修饰的组蛋白（见图 2）；具体来说，这些修饰包括组蛋白 H3 中赖氨酸（K）残基的甲基化（me）或乙酰化（ac）。以下是一些最常研究的组蛋白修饰及其已知的功能。

    活化

    H3K4me1 – 增强子
    H3K4me3 – 启动子
    H3K36me3 – 基因体
    H3K9ac – 启动子，基因富集区域
    H3K27ac – 卫星重复序列、端粒、核周细胞、反转录转座子阻遏
    H3K27me3 – 增强子、启动子
    H3K9me3 – 增强子、启动子


    图 2. 最常见的组蛋白修饰。

    总之，这些组蛋白修饰（图 2）组成了所谓的组蛋白密码，而组蛋白密码决定了局部基因组区域的转录状态。检查特定区域或整个基因组的组蛋白修饰，可以揭示基因激活状态，以及启动子、增强子和其他基因调控元件的位置。

    您可以通过这份指南，了解关于组蛋白修饰的更多信息。

    转录因子

    您还可以使用 ChIP 分析转录因子和其他 DNA 结合蛋白的位置。例如，我们知道多能性转录因子（例如 Oct4 和 Nanog）会结合并激活早期胚胎的首批合子表达基因的转录。如果您使用早期胚胎的染色质进行这些因子的 ChIP，您下拉的 DNA 片段将是这些早期合子表达基因。使用 DNA 结合蛋白的另一个例子是，如果您对 RNA 聚合酶 II 进行 ChIP，您将发现其在活性转录基因内、启动子区域内和整个基因体内存在富集现象。在失活基因中检测不到高水平的 RNA 聚合酶 II。

    以下视频详细介绍了染色质结构及其修饰，并且提供了使用 ChIP 研究组蛋白修饰及转录因子的具体案例。


    1.4 基于 ChIP 的先进方法

    传统 ChIP 充当了一个跳板，人们基于其开发出了新的应用类型，这些类型的应用通常将 ChIP 与其他技术搭配使用，以解决不同的生物学问题。例如 ChIP-loop 技术，该技术利用交联染色质的限制性消化和相互作用片段的连接来确定基因组的三维结构。ChIP 还可以与重亚硫酸盐转化 (BisChIP-seq) 等表观遗传学技术结合，用于研究组蛋白修饰和 DNA 甲基化之间的相互作用。

    通过末端配对标签测序法 (ChIA-PET) 进行染色质相互作用分析需要同时借助 ChIP 和 3C 技术。ChIA-PET 是 ChIP - loop 的高通量版本，能够通过目标蛋白在整个基因组范围内检测长程染色质相互作用。

    对传统 ChIP 进行非常细微的修改就可以用 ChIP-exo 来以单核苷酸分辨率检测蛋白结合。ChIP-exo 使用限制性酶切和新一代测序技术确定全基因组蛋白结合，分辨率高。ChIP-exo 的分辨率几乎比所有其他基于 ChIP 的技术都要高。

    您可以查看这份指南中有关 ChIP 最新先进技术的更多信息。

    小结

    现在，您应该对 ChIP 基础知识有了更好的了解。以下是一个简短的小结：

    • ChIP 可以帮您分析结合到基因组内特定区域的蛋白的定位
    • 通过评估蛋白质-DNA 在自然条件下的相互作用，ChIP 有助于我们了解核心生物学过程和疾病病理学
    • 染色质由组蛋白和 DNA 组成
    • 染色质主要有两种类型：异染色质和常染色质，这两种染色质对基因表达的影响不同
    • ChIP 用于检测组蛋白修饰和 DNA 结合蛋白
    • ChIP 基本方案可用于其他更先进的技术

    在第 2 部分，我们将为您介绍交联和自然 ChIP 实验方案，以及如何从组织和植物样本中制备染色质。

    现在开始学习第 2 部分吧！